熒光定量PCR儀的PCR技術(shù)擴(kuò)增時(shí)引物與己提供DNA雙鏈有何關(guān)系？單鏈DNA在互補(bǔ)寡聚核苷酸片段的引導(dǎo)下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA。這時(shí)單鏈DNA稱(chēng)為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱(chēng)為引物，合成的互補(bǔ)DNA稱(chēng)為產(chǎn)物DNA。雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應(yīng)的引物引導(dǎo)下，用DNA聚合酶復(fù)制出產(chǎn)物DNA。PCR反應(yīng)應(yīng)用以上的基本過(guò)程，分別在待復(fù)制的已知序列DNA分子兩端各設(shè)計(jì)一條引物，其中在DNA 5’端的引物（Pl）對(duì)應(yīng)于上鏈DNA單鏈的序列，3’端的引物（P2）對(duì)應(yīng)于下鏈DNA單鏈的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs的緩沖液中，通過(guò)高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復(fù)性，使引物與模板DNA配對(duì)，利用DNA聚合酶便可合成產(chǎn)物DNA。引物和dNTPs過(guò)量，則在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過(guò)程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物DNA可作為后一循環(huán)的模板DNA參與DNA的合成，使產(chǎn)物DNA的量按2n方式擴(kuò)增，所以這一反應(yīng)稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)。理論上如果引物及dNTP的量能夠滿足，則這一過(guò)程可無(wú)限重復(fù)，使模板DNA無(wú)限擴(kuò)增。
　　熒光定量PCR儀反應(yīng)使幾個(gè)DNA模板分子通過(guò)數(shù)小時(shí)擴(kuò)增后增加到百萬(wàn)倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時(shí)也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學(xué)及基因工程中極為有用的研究手段。另外在醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷中亦體現(xiàn)出很大的應(yīng)用價(jià)值。
　　常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴(kuò)增，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為25～35，變性溫度為94℃，復(fù)性溫度為37℃～55℃，合成延伸溫度為72℃，DNA聚合酶為T(mén)aq酶，DNA擴(kuò)增倍數(shù)為106～109。
　　引物的設(shè)計(jì)在熒光定量PCR儀反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，由于影響引物的設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常常利用計(jì)算機(jī)來(lái)輔助設(shè)計(jì)。